灯盏生脉（DengzhanShengmai，DZSM）是目前为数不多的具有循证医学证据的脑卒中二级预防用中成药，由4种中药材组成，分别是灯盏细辛、人参、麦冬和五味子，临床用于缺血性心脑血管疾病的恢复期治疗。我们近期基于代谢组学、蛋白组学和膜片钳等分析技术，揭示了灯盏生脉改善慢性脑缺血损伤的活性物质和作用机制，为灯盏生脉的临床应用提供支撑。研究方案见图1A：（i）首先构建双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）的大鼠慢性脑缺血模型，以此为基础开展了灯盏生脉给药后的代谢组学和蛋白组学研究，进一步通过多组学数据相互作用分析，预测了灯盏生脉改善慢性脑缺血的关键代谢通路；（ii）研究灯盏生脉在2VO模型大鼠血浆和脑组织的暴露成分；（iii）采用谷氨酸诱导的兴奋*性神经元损伤细胞模型，验证灯盏生脉在大鼠体内暴露成分对关键内源性代谢物和突触相关蛋白的影响，并最终通过膜片钳分析方法验证了灯盏生脉的活性物质和作用机制。
图1研究方案及药效评价结果
（A）研究方案设计；（B）假手术组、模型组和给药组HE染色结果；（C）假手术组、模型组和给药组水迷宫实验结果；（D）假手术组、模型组和给药组生化指标测定结果
在代谢组学和蛋白组学研究中，分为假手术组（Sham）、模型组（Mod）和灯盏生脉给药组（DZSM），苏木精-伊红染色（HE）结果表明，模型组海马CA1区细胞呈现明显病理样变化，而灯盏生脉给药组明显改善（图1B）。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等生化指标结果显示灯盏生脉可改善造模引发的氧化应激损伤（图1D）。在动物行为学评价方面，水迷宫实验（空间探索实验和定位航行实验）结果表明，灯盏生脉具有改善大鼠学习和记忆功能的作用（图1C）。
基于安捷伦HPLC色谱系统和iFunnelQ-TOF高分辨质谱仪开展灯盏生脉代谢组学研究，采用非靶向代谢组学分析方法对假手术组、模型组和模型给药组大鼠的靶器官脑组织与血浆样品进行分析，应用SIMCA-P软件对测定的代谢物相对含量进行主成分分析（PCA）（图2A和B）和偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），最终在血浆样品中得到39个（ModvsSham）和44个潜在生物标志物（DZSMvsMod），在脑组织中得到34个（ModvsSham）和29个潜在生物标志物（DZSMvsMod），部分潜在生物标志物热图分析见图2C。对这些潜在生物标志物进行代谢通路富集分析，结果表明其主要与氨基酸代谢、组胺代谢、维生素代谢、肌苷代谢等相关（图2D），代谢通路拓扑分析结果显示，谷氨酰胺-谷氨酸-γ-氨基丁酸（Gln-Glu-GABA）代谢处于代谢网络的核心位置，灯盏生脉对该代谢通路相关的多种代谢物具有显著的调节作用，灯盏生脉可明显降低血浆和脑组织中的谷氨酰胺和谷氨酸含量，提高GABA含量，有助于改善慢性脑缺血引发的兴奋*性神经元损伤（图2E）。
图2基于2VO模型的灯盏生脉代谢组学研究
（A）假手术组、模型组和给药组血浆样本代谢物PCA分析；（B）假手术组、模型组和给药组脑组织样本代谢物PCA分析；（C）血浆和脑组织中潜在生物标志物热图分析；（D）血浆和脑组织中潜在生物标志物代谢通路富集分析；（E）灯盏生脉对Gln-Glu-GABA代谢平衡的影响
在TMT标记的全蛋白组和磷酸化蛋白组研究中，共鉴定得到个蛋白和个磷酸化蛋白（图3A和B）。定量分析结果表明，假手术组和模型组相比，可鉴定得到45个差异蛋白和10个磷酸化差异蛋白；灯盏生脉给药组和模型组相比，可鉴定得到个差异蛋白和19个磷酸化差异蛋白，在这些差异蛋白中，灯盏生脉给药组可回调多种模型组差异蛋白，其中包括部分神经元突触相关蛋白（图3C和D）。蛋白功能注释分析（GO）结果表明，这些差异蛋白与神经递质转运、突触囊泡、记忆与衰老、ATP合成等多种神经元功能相关（图3F和G）。进一步通过免疫印迹试验（westernblot）验证了与神经元突触功能密切相关的Cck蛋白和Pvalb蛋白，证实了灯盏生脉对神经元突触的调节作用（图3E）。
图3基于2VO模型的灯盏生脉蛋白组学研究
（A）全蛋白组和磷酸化蛋白组鉴定蛋白韦恩图；（B）全蛋白组和磷酸化蛋白组在各组间的表达变化；（C）全蛋白组分析中给药组与模型组间差异蛋白；（D）磷酸化蛋白组分析中给药组与模型组间差异蛋白；（E）Cck和Pvalb蛋白westernblot表达；（F）差异蛋白富集通路分析；（G）差异蛋白相互作用关系分析
在代谢组学和蛋白组学研究的基础上，应用安捷伦MassProfilerProfessional（MPP）软件整合分析了代谢组学和蛋白组学数据，对代谢组学得到的潜在生物标志物和蛋白质组学得到的差异蛋白进行关联分析，分析结果表明这些关键代谢物和蛋白均与N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体家族和GABA受体家族密切相关（图4A-C），即灯盏生脉可能通过对谷氨酸能突触和GABA能突触调节而发挥神经保护作用（图4D）。进一步研究发现，灯盏生脉对突触前兴奋性和抑制性神经递质囊泡转运蛋白vIAAT和vGluT1有调节作用，对突触后磷脂酶A2和相关脂质代谢（花生四烯酸、磷脂和溶血磷脂等）有调节作用，这些结果进一步证明了灯盏生脉对神经元突触的调节作用（图4E-G）。
图4代谢组学和蛋白组学整合分析
（A）应用MPP软件进行差异代谢物和蛋白相互作用关系分析；（B）相互作用关系中涉及的各代谢物组间含量图；（C）相互作用关系中涉及的各蛋白组间表达量图；（D）灯盏生脉对突触前端和突出后端的调节作用；（E）灯盏生脉对vIAAT、vGluT1、cPLA2、花生四烯酸的调节作用；（F）灯盏生脉对磷脂代谢的调节作用；（G）灯盏生脉对溶血磷脂代谢的调节作用
为验证灯盏生脉对谷氨酸能和GABA能神经元突触的调节作用，应用SH-SY5Y细胞建立了谷氨酸诱导的兴奋*性神经元损伤细胞模型，研究灯盏生脉在靶器官脑组织中暴露成分对神经递质转运相关代谢物和蛋白的调节作用。结果表明灯盏生脉在大鼠脑组织的9个原型成分中灯盏甲素、灯盏乙素、3-咖啡酰奎宁酸、4,5-咖啡酰奎宁酸和人参皂苷Rg1可显著提高造模后的细胞生存率，并且具有剂量依赖性（图5B-F），同时灯盏甲素、灯盏乙素、3-咖啡酰奎宁酸、4,5-咖啡酰奎宁酸可显著调节神经元突触相关代谢物（如谷氨酸、谷氨酰胺、GABA、牛磺酸、亚精胺等）的含量（图5G）。Westernblot结果显示，4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素对NMDA受体2b亚型及GABAA受体α1亚型具有显著调节作用，4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素可显著抑制NMDA2b受体的表达，升高GABAAα1受体的表达，降低谷氨酸诱导的兴奋*性神经元损伤（图5H和I）。
图5灯盏生脉脑组织暴露成分对谷氨酸诱导的兴奋*性神经元损伤细胞的调节作用
（A）计算谷氨酸造模的IC50值；（B-F）目标化合物对模型细胞生存率的影响；（G）目标化合物对模型细胞关键内源性代谢物的影响；（H）4,5-咖啡酰奎宁酸对GABAAα1受体表达的影响；（I）4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素对NMDA2b受体表达的影响
进一步通过膜片钳技术分析4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素对NMDA2b受体和GABAAα1受体膜电位的影响，实验结果表明，4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素可显著激活GABAAα1受体，EC50分别为48.74μmol/L和29.77μmol/L。表明这两个化合物可能为GABAA受体的正变构调节因子（图6A-D）。同时膜片钳结果表明灯盏乙素可抑制NMDA2b受体的激活（图6E-H）。这些细胞实验结果表明4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素为灯盏生脉的活性成分，其通过调节谷氨酸能和GABA能突触起到神经保护作用。
图64,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素对GABAA和NMDA受体通道的影响
（A-D）4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素以浓度依赖性方式激活GABAA受体通路；（E-H）灯盏乙素在10μmol/L浓度下抑制NMDA2b受体通路
总结：在慢性脑缺血发展进程中，较易发生NMDA受体过表达，进而产生神经元兴奋性损伤，降低大脑学习和记忆功能，这也是阿尔兹海默症等疾病的可能机制之一。本研究基于代谢组学、蛋白组学、膜片钳等多个技术，研究了灯盏生脉改善大鼠慢性脑缺血的活性成分和作用机制。4,5-咖啡酰奎宁酸和灯盏乙素等化合物可维持脑组织Gln-Glu-GABA平衡，调节谷氨酸过量诱导的NMDA受体过表达，同时增强GABAA受体的表达，调节受体膜电位水平，降低兴奋*性神经元损伤，发挥其神经保护作用，这可能是灯盏生脉改善慢性脑缺血损伤的作用机制，本研究为灯盏生脉治疗心脑血管疾病的临床应用提供了一定的科学依据。
本文文献
NingSheng#,HaoZheng#,MinLi,MenglinLi,ZheWang,YingPeng,HaiboYu*,JinlanZhang*.4,5caffeoylquinicacidandscutellarin,identifiedbyintegratedmetabolomicsandproteomicsapproachastheactiveingredientsofDengzhanShengmai,actagainstchroniccerebralhypoperfusionbyregulatingglutamatergicandGABAergicsynapses.PharmacologicalResearchC().
文献整理：生宁；编辑：生宁、张金兰；第期
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