摘要：目的探讨葛根素通过腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-Unc-51样激酶1（Ulk1）通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。方法40只雄性SD大鼠随机分为4组，即假手术组、模型组及葛根素低、高剂量（50、mg/kg）组。各组大鼠连续给药7d，末次给药30min后，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）模型，缺血1.5h再灌注24h后，进行神经功能评分，TTC染色观察脑梗死体积，电镜观察自噬小体的形成，Westernblotting法检测海马组织中微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、pS-Ulk1蛋白表达水平。结果与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著增加，脑梗死体积明显增大，自噬小体增多，LC3-II/LC3-I显著增加，p62蛋白表达水平显著降低，p-AMPK表达水平显著升高，p-mTOR和pS-Ulk1蛋白表达水平显著降低。与模型组比较，葛根素各组大鼠的神经功能损伤明显改善，脑梗死体积减小，自噬小体减少，LC3-II/LC3-I显著降低，p62蛋白表达水平显著升高，p-AMPK蛋白表达水平显著降低，p-mTOR和pS-Ulk1蛋白表达水平显著升高。结论葛根素可能通过调控AMPK-mTOR-Ulk1信号通路抑制自噬的过度发生，从而减轻脑缺血再灌注损伤的发生。
脑血管疾病已成为世界公认的第2大死亡原因[1]，同时也是我国的主要死亡病因[2]。缺血性脑病是最常见的脑血管疾病，尤其是缺血性脑卒中，占全部脑血管性疾病的60%～80%[3-4]。目前，缺血性脑病的主要治疗手段是溶栓治疗，然而在溶栓过程中，血流再次灌注可能给受损组织带来二次伤害，即脑缺血再灌注损伤（cerebralischemia-reperfusioninjury，CIRI），其涉及氧化应激、炎症、自噬、凋亡、内质网应激等一系列病理改变[5-7]。其中，自噬已被证实在CIRI中发挥着越来越重要的作用。葛根素是从葛根中提取的一种异*酮类单体化合物，已被广泛应用于缺血性脑病的临床治疗中，且具有良好的疗效。大量的研究证实，葛根素可以通过发挥抗炎[8]、抗细胞凋亡[9]、改善微循环[10]、抑制自噬[11]等作用减轻CIRI，然而其具体作用机制尚不清楚。
腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是维持代谢稳态的关键能量传感器，已被证实可诱导自噬的激活。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是AMPK下游重要的信号分子，在自噬调控中发挥着负向调节作用[12-13]。研究表明，AMPK和mTOR通过调节Unc-51样激酶1（Ulk1）的协同磷酸化，调控脑缺血诱导的自噬，脑缺血时AMPK被激活，进而抑制mTOR的磷酸化，致使mTOR与Ulk1的Ser位点结合减少而增加Ulk1-AMPK的相互作用，使Ulk1活化，诱导自噬的发生[14-15]。因此，本研究从AMPK-mTOR-Ulk1信号通路探讨葛根素干预调节自噬、防治缺血性脑卒中的潜在机制，为其临床推广应用提供理论依据。
1材料
1.1实验动物
健康雄性SD成年大鼠40只，SPF级，体质量～g，三峡大学医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（鄂）-。
1.2药物
葛根素注射液（批号FALT，规格0.2g/支）购自华北制药集团有限责任公司，使用前用生理盐水稀释至所需浓度。
1.3试剂
2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）试剂购自美国Sigma公司；山羊抗兔GAPDH购自武汉博士德生物有限公司；兔多抗微管相关蛋白1轻链3（LC3）购自美国Abcam公司；兔多抗p62、兔单抗AMPK、兔单抗p-AMPK、兔单抗mTOR、兔单抗Ulk1、兔单抗pS-Ulk1均购自英国CellSingling公司；10%水合氯醛均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.4仪器
DYY-7C电泳仪及DYCZ-40电转仪，北京六一仪器厂；TS-1水平摇床，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；LD25-2型低速离心机，北京京立离心机有限公司；H-透射电子显微镜，日本日立公司；倒置荧光显微镜，德国Leica公司。
2方法
2.1分组及给药
将40只大鼠随机分为假手术组、模型组及葛根素低、高剂量（50、mg/kg）组，每组各10只。适应性喂养3d后进行预处理，葛根素各剂量组大鼠每天分别ip葛根素50、mg/kg，共给药7d。假手术组与模型组大鼠ip给予相应的生理盐水5mL/kg。
2.2脑缺血再灌注损伤模型的制备
参照Longa等[16]的方法，应用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。大鼠末次给药30min后，ip10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉。待麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于操作板上，去除颈部细毛，酒精消*颈部皮肤，沿颈正中线切一小口，钝性分离颈前肌群，暴露出右侧颈总、颈外及颈内动脉。结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，动脉夹夹住颈总动脉远心端（避开迷走神经和气管）。在距颈总和颈内、外动脉分叉5mm处剪1个“V”型小口，将线栓从开口处插入颈内动脉，插入深度18～20mm（有阻力感觉），结扎颈内和颈总动脉远心端以固定线栓。逐层缝合切口，碘伏消*。术后将大鼠置于加热垫上，缺血90min后拔出线栓，再灌注24h。假手术组大鼠只分离血管，不插栓线，其他操作相同。
2.3检测指标
2.3.1神经功能评分参照Longa等[16]法进行神经功能障碍评分。0分：无神经功能活动障碍；1分：提尾时缺血侧前肢不能伸展；2分：大鼠不能直行，向左侧转圈；3分：行走困难，行走时向左侧转圈、倾倒；4分：严重意识障碍，无法行走或陷入昏迷。神经功能评分在0～3分的大鼠表明造模成功，纳入下一步实验，评分为4分的剔除实验。
2.3.2TTC染色测定梗死体积各组大鼠在缺血再灌注24h后，每组随机选3只ip10%水合氯醛1.5mL麻醉，断头取大脑，去嗅球、小脑和低位脑干，?20℃下冷冻20min后沿冠状面将大脑切成厚度基本相同的5份，置于以0.1mol/LPBS配制的0.2%TTC染色液中，37℃避光孵育30min后置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，取出切片吸干，拍照。采用Image-proplus6.0图像分析软件计算大鼠的脑梗死体积，计算梗死组织百分比（梗死脑组织百分比＝梗死区体积/大脑体积）。
2.3.3透射电镜检测自噬小体再灌注24h后，每组随机选2只大鼠ip10%水合氯醛1.5mL进行麻醉，用生理盐水灌注至大鼠肝脏及前肢变白后继续灌注4%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液，灌注成功后断头取脑，分离出脑组织，于缺血侧海马靠近CA1区取一块体积约为1mm3的脑组织块，放置于2.5%戊二醛溶液保存以固定。用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗脑组织块3次后置于1%锇酸固定液中，在4℃条件下固定1h。然后将组织块在梯度乙醇溶液中脱水并包埋在环氧树脂中，并在?80℃下聚合24h。用超薄切片机将组织块制作成60～70nm厚的超薄切片，然后用3%柠檬酸铅染色，随后使用透射电子显微镜观察自噬小体的形成情况。
2.3.4Westernblotting法检测LC3、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、Ulk1及pS-Ulk1蛋白的表达再灌注24h后，每组随机选选3只大鼠，麻醉后断头取脑，称取0.25g海马组织进行样品制备，用BCA法测定蛋白浓度，取40μg样品，以10%SDS-PAGE电泳进行分离，将分离的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗后4℃孵育过夜，TBST充分洗膜3次（10min/次）。将PVDF膜封入二抗稀释液中，室温摇床孵育1h，TBST洗膜3次（10min/次）。配制发光液，将发光液均匀滴在PVDF膜上，放入凝胶成像仪器内显影。以GAPDH为内参照，重复3次，用ImageJ软件进行灰度值分析。
2.4统计学分析
所有实验数据均采用SPSS19.0统计软件处理，以表示，各组数据比较采用单因素方差分析和LSD法。
3结果
3.1葛根素对MCAO大鼠神经功能缺损的影响
结果如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠均表现出严重的神经功能损伤情况（P＜0.01）。与模型组比较，葛根素低、高剂量组大鼠的神经功能评分均显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.2葛根素对MCAO大鼠脑组织梗死体积的影响
染色结果如图1所示，白色部分表示脑梗死区域，红色部分表示非梗死区域。统计结果如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，葛根素低、高剂量组大鼠脑梗死体积均显著减少（P＜0.05、0.01）。
3.3葛根素对MCAO大鼠脑组织缺血侧海马CA1区自噬小体形成的影响
大鼠脑缺血再灌注24h后，采用透射电镜法检测缺血侧海马CA1区的自噬小体形成情况，结果如图2所示，假手术组大鼠脑组织缺血侧CA1区神经
元相对正常，有较完整的细胞核、线粒体、溶酶体。而模型组大鼠脑组织缺血侧CA1区细胞形态破坏，神经元内出现较多空泡结构，并可见大量增加的溶酶体和自噬小体。与模型组比较，葛根素低、高剂量组大鼠CA1区自噬小体数量均减少，且细胞形态相对正常，可见相对完整的线粒体、溶酶体和内质网。
3.4葛根素对MCAO大鼠脑组织缺血侧海马中LC3和p62蛋白表达的影响
结果如图3和表3所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织缺血侧海马中LC3-II/LC3-I显著升高，而p62蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，葛根素低、高剂量组大鼠脑组织缺血侧海马中LC3-II/LC3-I显著降低，p62蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。
3.5葛根素对MCAO大鼠脑组织缺血侧海马中p-AMPK、p-mTOR及pS-Ulk1蛋白表达的影响
结果如图4和表4所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织缺血侧海马中p-AMPK蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），p-mTOR和pS-Ulk1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，葛根素低、高剂量组大鼠脑组织缺血侧海马可逆性脑损伤。因此，寻求防治CIRI发生的有效药物对缺血性脑病治疗和康复至关重要。葛根素是从葛根中提取的一种异*酮类单体，在防治脑血管疾病方面疗效显著[19-20]。本课题组前期针对葛根素防治缺血性脑卒中的一项Meta分析显示，葛根素注射液的疗效与对照组相比更加有效且安全[21]。前期动物实验研究[22]亦显示，葛根素注射液能显著降低白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子的表达，提示葛根素防治CIRI的机制可能与胆碱能抗炎通路有关。此外，其他研究还显示葛根素在防治CIRI中优势明显，Wang等[20]研究发现，葛根素可通过减少星形胶质细胞的凋亡减轻CIRI。Xu等[9]研究表明，葛根素能显著抑制MCAO模型大鼠Caspase-3活性，通过抗神经元细胞凋亡发挥神经保护作用。最新研究[11]发现，葛根素能通过调控自噬防治CIRI的发生，然而其具体的作用机制尚不明晰。本研究探讨葛根素预处理对CIRI中的保护作用，并探明葛根素通过调控自噬发挥作用的潜在机制，结果显示，与模型组比较，葛根素预处理能显著改善缺血再灌注24h后大鼠的神经功能缺损情况，减少脑梗死体积，提示葛根素预处理发挥了神经保护作用。
LC3是自噬过程中最重要的蛋白分子，有LC3-I和LC3-II2种存在形式，主要参与自噬体的形成[23]。选择性自噬接头蛋白p62在泛素化蛋白和LC3之间起桥梁作用，在C端与泛素化蛋白结合，并通过N端与LC3-II结合从而参与自噬的降解[24]。因此，同时检测LC3和p62可以反映自噬流的完整性。透射电镜结果显示，与模型组比较，葛根素预给药能明显抑制大鼠缺血侧海马CA1区自噬小体的形成。Westernblotting结果显示，与模型组比较，葛根素预处理能显著逆转LC3-II/LC3-I的升高，同时上调p62蛋白的表达，故推测葛根素预处理可能通过抑制大鼠再灌注24h后自噬的过度产生而发挥神经保护作用。目前，自噬在CIRI中的作用尚有争议，有研究[25-26]认为缺血再灌注后自噬的激活有利于减轻CIRI，然而也有研究[27-28]显示，抑制缺血再灌注后的自噬能改善脑缺血引起的神经元的损伤。研究发现自噬的这种双重作用可能是由于再灌注的时间以及自噬的检测时间点不同造成的[25]。目前已有的研究[29]显示，自噬的峰值在12～24h，适度的自噬在脑缺血中可能发挥神经保护作用，而过度的自噬可能会诱导细胞死亡。基于上述理论，自噬的调节可能成为缺血性脑病潜在的治疗靶点。因此，深入探讨自噬在CIRI中的具体作用机制，可以为探讨缺血性脑病的发病机制及其用药提供新的思路。
研究显示，AMPK-mTOR-Ulk1信号通路在调控自噬防治缺血性脑病中发挥着重要作用[30-31]。AMPK活化后激活磷酸化结节性硬化复合体（TSC1/2），进而抑制小GTP酶Rheb，负向调控mTOR[32]。AMPK通过磷酸化联接蛋白raptor，阻碍raptor与mTOR或mTOR与底物的结合，同样可以抑制mTOR的活化[33]。此外，AMPK还可以直接磷酸化mTOR并导致自身磷酸化水平下降[34]。目前，越来越多的研究证实，当细胞处于异常状态时，活化的AMPK能够抑制mTOR的活性，导致mTOR与Ulk1Ser位点的复合体解离，从而使Ulk1的激活，促进自噬的发生[15,35-37]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠p-AMPK的表达上调而p-mTOR的表达下调，证实AMPK与mTOR在自噬的调节中确实发挥着相反的作用。同时pS-Ulk1的表达下降，与p-mTOR的表达趋势一致，提示在脑缺血再灌注24h后，磷酸化的AMPK能够降低mTOR的磷酸化，抑制mTOR与Ulk1Ser位点的相互作用，进而促进自噬的发生。此外，本研究中，葛根素预处理能显著降低p-AMPK蛋白的表达水平，提高p-mTOR和pS-Ulk1蛋白的表达水平，提示葛根素预处理可能通过抑制AMPK的活化促进mTOR的磷酸化，进而促进Ser-Ulk1的磷酸化，增加mTOR与Ser位点的结合，从而抑制自噬的过度发生来改善脑缺血再灌注损伤。
综上所述，本研究显示，葛根素预处理可能通过抑制AMPK-mTOR-Ulk1信号通路，进而抑制大脑海马区的过度自噬，进而发挥对CIRI的保护作用。然而葛根素是否通过其他的信号通路调控自噬发挥作用仍有待进一步探索。明确其在CIRI中的具体作用机制，将为葛根素的临床应用提供理论依据，也为临床缺血性脑病的治疗提供新的思路。
参考文献（略）
来源：*亚光，王金凤，杜利鹏，张微，梅志刚.葛根素调节AMPK-mTOR信号通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤研究[J].中草药,,50(13):-.
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇