陈勇1范*朝2庞红利1彭莉1王莹3
1医院麻醉与围术期医学科，开封；2医院医学部，开封；3河南大学医学院，开封
国际麻醉学与复苏杂志,,42(01):8-14.
DOI：10./cma.j.cn-?
基金项目
河南省高等学校重点科研项目（19A）
ORIGINALARTICLES
本研究以局灶性脑缺血/再灌注（I/R）损伤大鼠为模型，观察七氟醚后处理对大鼠神经功能、脑组织病理学、血脑屏障、脑细胞凋亡及活性氧（ROS）/硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）/NOD样受体相关蛋白3（NLRP3）信号通路的影响，初步探究七氟醚后处理对脑保护的分子机制。
1材料与方法
60只SD雄性大鼠按随机数字表法分为假手术组（sham组）、I/R组、七氟醚后处理组（SP组），每组20只。采用大脑中动脉线栓法制备脑I/R模型，SP组造模后即刻吸入2.4%七氟醚30min。对各组大鼠进行神经功能缺损评分；获取大鼠脑组织，H?E染色和2，3，5?氯化三苯基四氮唑（TTC）染色观察组织病理学变化和脑梗死体积；分析大鼠脑水肿程度及血脑屏障通透性；TUNEL法检测脑组织细胞凋亡率；检测血清炎性因子（IL?1β和IL?18）及脑组织氧化应激指标［ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）］的水平；Westernblot法检测TXNIP/NLRP3通路相关蛋白［TXNIP、NLRP3、凋亡相关点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸酶?1（caspase?1）］的表达。
2结果
2.1 七氟醚对大鼠神经功能缺损评分的影响
I/R6、12h和24h后，3组大鼠神经功能缺损评分如图1所示。与sham组比较，I/R组和SP组大鼠的神经功能缺损评分均明显升高，但SP组大鼠的神经功能缺损评分低于I/R组（P0.05）。
2.2 七氟醚对大鼠脑组织病理学及脑梗死体积的影响
H?E染色结果显示，sham组大鼠脑组织形态规则，细胞核圆且核仁明显。I/R组大鼠神经细胞明显减少，排列紊乱，细胞核固缩，多数细胞坏死。与I/R组比较，SP组大鼠脑组织病理学损害有所减轻，坏死细胞明显减少。见图2。
TTC染色结果显示，sham组大鼠无脑梗死区域，I/R组和SP组大鼠脑梗死体积百分比分别为（37.18±3.21）%和（23.66±2.37）%，SP组明显低于I/R组（P0.05）。
2.3 七氟醚对大鼠脑含水量及血脑屏障通透性的影响
与sham组比较，I/R组和SP组脑含水量和EB含量明显升高（P0.05）；与I/R组比较，SP组脑含水量和EB含量明显降低（P0.05）。见图3。
进一步采用Westernblot法检测与血脑屏障通透性密切相关的MMP?9的表达，结果发现与sham组比较，I/R组中MMP?9蛋白的表达水平明显增加，而SP组中MMP?9的表达水平明显低于I/R组（P0.05）。见图4。
2.4 七氟醚对大鼠脑组织细胞凋亡的影响
TUNEL染色结果如图5所示，sham组、I/R组和SP组脑组织中细胞凋亡指数分别为（1.47±0.31）%、（27.31±2.68）%和（9.11±1.73）%。与sham组比较，I/R组和SP组脑组织中细胞凋亡率明显升高，而SP组中细胞凋亡率明显低于I/R组（P0.05）。
Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bcl?2和Bax的表达结果同样发现，与sham组比较，I/R组和SP组中Bcl?2的表达下降，而Bax表达水平升高；SP组中Bcl?2表达水平明显高于I/R组，而Bax表达水平明显低于I/R组（P0.05）。见图4。
2.5 七氟醚对血清炎性因子及氧化应激指标的影响
各组大鼠血清炎性因子及脑组织中氧化应激指标的含量见图6。与sham组比较，I/R组血清中IL?1β、IL?18含量及脑组织中ROS、MDA含量均明显升高，而抗氧化酶GPx和SOD活性明显下降（P0.05）。与I/R组比较，SP组血清中IL?1β、IL?18含量及脑组织中ROS、MDA含量均明显降低，但GPx和SOD活性明显升高（P0.05）。
2.6 七氟醚对脑组织中TXNIP、NLRP3、ASC和caspase?1蛋白含量的影响
Westernblot法检测结果显示，与sham组比较，I/R组大鼠脑组织中TXNIP、NLRP3、ASC和caspase?1蛋白含量升高（P0.05）；与I/R组比较，SP组中TXNIP、NLRP3、ASC和caspase?1蛋白含量明显降低（P0.05），见图7。
3讨论
本研究采用低剂量七氟醚后处理脑I/R损伤大鼠，发现其能够降低大鼠神经功能缺损评分，减少脑梗死体积，改善脑组织损伤、水肿程度及血脑屏障通透性，在一定程度上抑制脑细胞的凋亡，发挥脑I/R损伤的保护作用。本研究结果同样发现，七氟醚后处理能够抑制脑I/R损伤大鼠的氧化应激及炎症反应。
本研究通过对脑I/R损伤大鼠进行七氟醚后处理，观察大鼠脑组织中ROS/TXNIP/NLRP3信号通路的变化，探究七氟醚脑保护作用的分子机制。本研究中采用七氟醚后处理大鼠脑I/R损伤同样发现，ROS含量及TXNIP、NLRP3、ASC和caspase?1蛋白水平显著降低，且血清炎症因子及脑组织氧化应激指标也显著变化，提示七氟醚能够降低I/R小鼠脑组织中ROS的含量，抑制TNXIP/NLRP3等炎性小体相关蛋白的聚集及激活，抑制下游氧化应激指标及炎症因子的释放，从而抑制脑组织细胞的凋亡，减轻脑组织损伤及神经功能异常。
综上所述，七氟醚后处理能够抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路，有效减轻大鼠脑I/R损伤，这可能是七氟醚发挥脑保护作用的机制之一，也为临床治疗缺血性脑损伤提供了一定的参考。但本研究中尚未设计挽救实验验证七氟醚与ROS/TXNIP/NLRP3信号通路的相互作用，因此关于七氟醚是否通过抑制该通路保护大鼠脑I/R损伤还有待进一步证实。
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