介绍铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡，是以过度的铁依赖性脂质过氧化为特征。铁的存在对于铁死亡的执行是必不可少的。调节铁代谢的基因和蛋白质可以调节铁死亡的敏感性。铁蛋白的选择性自噬周转过程在控制铁稳态中起着关键作用，并与铁死亡密切相关。
铁吞噬作用是由核受体共激活因子4(NCOA4)介导的，NCOA4是一种新近发现的自噬货物受体。铁蛋白由24个亚基的重(FTH1)和轻(FTL)亚基组成，是一种胞内储铁蛋白复合体。在铁蛋白噬菌体中，受体NCOA4直接识别和结合FTH1，然后将铁结合的铁蛋白输送到自噬体内，进行溶酶体降解和铁的释放，可以引发铁死亡。
越来越多的证据表明，铁死亡与许多神经疾病相关的病理细胞死亡有关，包括神经退行性疾病和中风。在本文中，作者发现了化合物9a为NCOA4的第一个配体和NCOA4?FTH1相互作用的抑制剂。这是阻止铁死亡的新策略，而且这为开发新的治疗方案来对抗神经系统疾病提供了新的方法。
结果与讨论
图一：合成的苯并咪唑类化合物的结构。
图二：化合物9a可抑制铁死亡
1.一种有效的铁死亡抑制剂的发现。
作者发现一些苯并咪唑衍生物可以抑制谷氨酸诱导的HT22细胞铁死亡和Erastin诱导的HT22细胞铁死亡。为了探索铁死亡抑制活性空间，作者设计并合成了一个新的苯并咪唑衍生物文库。在第一代文库中，4a是最有效的化合物。在第二代文库中，最有效的化合物9a被选为进一步的抗铁死亡评估。
作者发现含9a的HT22细胞、经典的铁死亡抑制剂Fer-1或DFO共同处理显着降低了半胱氨酸消耗导致的细胞死亡水平。在BSO诱导，GPX4共价抑制剂或ML诱导的HT22细胞铁死亡中，9a阻止了细胞死亡。此外，9a抑制Erastin、RSL3或ML在HT-人纤维肉瘤细胞中诱导的铁死亡。
脂质过氧化是铁死亡的标志。在HT22细胞中，RSL3诱导了显着的脂质ROS积累，而9a或Fer-1可以阻止ROS的积累。此外，9a抑制了HT-细胞中GPX4敲低诱导的脂质ROS积累和HT22细胞中RSL3诱导的细胞溶质ROS积累和PTGS2表达的上调。综上所述，9a是一种选择性的铁死亡抑制剂，可有效抑制脂质过氧化并拯救细胞免于铁死亡。
图三：化合物9a减少了生物可利用的亚铁的量，以阻止铁死亡。
2.化合物9a通过减少细胞内游离Fe2+的量来抑制铁死亡。
上述实验表明，9a抑制了由直接失活或消耗GPX4诱导的铁死亡，不改变细胞内GSH水平或GPX4表达，所以可能抑制GPX4下游或平行于GPX4的铁死亡。实验发现9a不能像Fer-1和Lip-1直接清除自由基。9a也不能螯合Fe3+或Fe2+。
为了探讨了9a是否可以改变活细胞中可用的Fe2+水平，作者使用Fe2+选择性荧光探针。与用DFO处理的相似，在HT22细胞中，荧光强度在用9a处理后显着降低，表明9a降低了游离Fe2+的水平。为了进一步证实9A通过降低细胞内生物可利用的Fe2+的量来抑制铁死亡，作者研究了添加铁对9A抑制铁死亡活性的影响。用三种不同的外源铁源处理HT22细胞，废除或显着降低了9a从RSL3诱导的铁死亡中拯救细胞的能力。综上所述，化合物9a通过减少细胞内游离Fe2+的量来抑制铁死亡。
图四：化合物9a抑制溶酶体铁蛋白降解并定位于自噬体。
3.化合物9a抑制溶酶体中铁蛋白复合物的降解（铁蛋白吞噬）并定位于自噬体。
为了验证9a抑制铁蛋白吞噬的假设，通过Westernblotting测定了铁蛋白的水平，在9a治疗后，铁蛋白的蛋白水平以一种剂量依赖的方式增加。此外，9a没有改变FTH1和FTL的mRNA表达。为了进一步验证9a抑制溶酶体铁蛋白的降解，作者进行了免疫荧光实验来观察铁蛋白溶酶体的定位。结果发现，细胞表现出点状的铁蛋白溶酶体定位，而9a的存在导致铁蛋白的弥漫染色。在激光共聚焦扫描显微镜下，在HT22和HT-细胞中，9A以点状囊泡的形式聚集在细胞质中。此外，通过免疫荧光染色，作者发现9a在自噬体内积累。
综上所述，9a阻止了铁蛋白与溶酶体的共定位，并导致铁蛋白吞噬功能受损，在自噬体内积累。
图五：化合物9a破坏NCOA4-FTH1相互作用并与NCOA4结合。
3.化合物9a通过与细胞中的NCOA4结合破坏NCOA4-FTH1相互作用来抑制铁蛋白吞噬。
通过免疫共沉淀(co-IP)测定，作者研究了9a是否消除了NCOA4-FTH1相互作用以抑制铁蛋白吞噬。结果发现，9a削弱了NCOA4-FTH1的相互作用。此外，9a还抑制了内源性NCOA4与FTH1的相互作用。
为了证明9a直接结合NCOA4而不是FTH1，作者在活细胞中测试了9a是否与NCOA4共定位。通过质粒转染，作者发现9a几乎完全位于EGFP-NCOA4斑点中，表明9a靶向活细胞中的NCOA4。为了进一步证实9a与NCOA4的结合，作者通过将生物素-PEG3-N3与活性炔烃化合物结合来合成生物素标记的化学探针（Biotin-14d），用此进行生物素-链霉亲和素下拉实验。结果发现，只有NCOA4被Biotin-14以剂量依赖性方式特异性下拉，Biotin-14d与NCOA4的结合被9a竞争性抑制。总体而言，这些结果表明9a与NCOA4结合并阻断其与活细胞中FTH1的相互作用，从而抑制铁蛋白吞噬。
图6：化合物9a直接结合NCOA-并抑制NCOA--FTH1相互作用。
5. 化合物9a直接结合NCOA-蛋白并抑制NCOA--FTH1相互作用据报道，NCOA4通过含有氨基酸-的片段与FTH1结合，并且NCOA-也是活细胞中铁蛋白吞噬所必需的。作者进一步探索9a与NCOA-的关系。通过银染和免疫印迹检测，体外重组NCOA-蛋白被合成的生物素标记探针Biotin-14d以剂量依赖性方式拉下，而9a可以阻断NCOA?和Biotin-14d的结合。此外，通过一种酶联免疫吸附试验，作者发现9a显着破坏了NCOA4-FTH1相互作用。综上所述，化合物9a直接结合NCOA-蛋白并抑制NCOA--FTH1相互作用。
图7：给予9A可减轻MCAO模型的缺血再灌注损伤。
3.化合物9a减轻暂时性大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的脑缺血性损伤。
缺血性中风是血管闭塞的结果。铁死亡通路参与了缺血性中风的病理过程，抑制铁死亡可以减轻活体缺血性脑损伤。作者评估了9a在脑缺血模型中是否具有保护作用。与对照组相比，在脑缺血模型中，9A治疗，降低了PTGS2的基因表达，降低了MDA和4-HNE的水平，使大多数神经细胞保持在规则的形状，并减少了皮层中受损神经元的百分比，改善了局灶性脑缺血后的神经功能障碍，对脑缺血损伤起保护作用。综上所述，活体数据表明，9a通过抑制铁死亡有效地减轻了脑缺血损伤。
总结在本文中，作者报道了一种新的铁死亡抑制剂9a。化合物9a直接结合NCOA-蛋白并抑制NCOA--FTH1相互作用，减少细胞内生物可利用的亚铁含量，从而抑制铁死亡。在大鼠缺血性卒中模型中，9a可显著改善缺血再灌注损伤。这项工作为开发抗神经系统疾病的铁死亡抑制剂铺平了一条新的道路。
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